免疫組化IHC常見問題

發(fā)布時(shí)間： 2024-03-14　　點(diǎn)擊次數(shù)： 723次

IHC信號(hào)微弱/無信號(hào)
問題	解決方案
抗體效力	a. 抗體效價(jià)不高?？赏ㄟ^增加抗體使用濃度，延長抗體孵育時(shí)間進(jìn)行調(diào)整。 b. 所用抗體不適用于IHC實(shí)驗(yàn)。建議在非變性WB上測試該抗體，以確?？贵w識(shí)別非變性抗原，或是選用通過IHC實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的抗體。 c. 一抗二抗不匹配。使用針對(duì)一抗物種來源的二抗，如一抗宿主為rabbit，則須使用anti-rabbit的二抗。 d. 抗體失活。避免將標(biāo)記熒光基團(tuán)的二抗放置于光照環(huán)境。
酶底物失活或呈色時(shí)波長設(shè)置錯(cuò)誤	a. 顯色溶液失去作用，可能是由于底物緩沖液中含有酶抑制劑，或底物緩沖液的pH值不適當(dāng)。建議取一滴二抗標(biāo)記酶與底物溶液反應(yīng), 可確認(rèn)顯色溶液是否失去活性。 b. 錯(cuò)誤的激發(fā)波長。呈色前確保激發(fā)波長與使用的熒光基團(tuán)相匹配。
樣品制備問題	a. 脫蠟作用不足。建議延長脫蠟時(shí)間，使用新鮮配制的二甲苯。 b. 固定液（福爾馬林或 PFA) 可能改變表位。建議利用抗原修復(fù)方式使表位暴露出來或縮短固定作用的時(shí)間。 c. 固定作用不適當(dāng)。避免延遲固定或過度固定，一般建議至少固定6小時(shí)以上，18~24小時(shí)已可滿足大多數(shù)實(shí)驗(yàn)應(yīng)用。 d. 冰凍切片樣品保存期過長。冰凍切片制備完成后，最好于1-2個(gè)月內(nèi)用完，超過6個(gè)月的話，建議制備新的玻片。 e. 熒光染色樣品保存不當(dāng)。熒光基團(tuán)在光線下暴露時(shí)間過長，可能會(huì)導(dǎo)致信號(hào)減弱，建議在避光環(huán)境下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)和保存樣品，也可使用防熒光淬滅的封片劑封固樣本。
樣品屬性	a. 靶蛋白含量低。建議設(shè)置為陽性対照組，增加抗體使用量或利用放大步驟來放大信號(hào)。 b. 靶蛋白為核蛋白而抗體不能穿透細(xì)胞核。建議在封閉溶液與抗體稀釋液中加入滲透試劑，以促進(jìn)抗體滲透到細(xì)胞內(nèi)。 c. 靶蛋白為膜蛋白而表位可能因?yàn)闈B透作用被破壞或移除。建議將緩沖液中的滲透試劑減少或移除。 d. 較厚的組織。如斑馬魚全胚胎或染色建議做細(xì)胞破膜，以便抗體順利進(jìn)入胞內(nèi)與相應(yīng)抗原結(jié)合。關(guān)鍵步驟：在每次的實(shí)驗(yàn)中，設(shè)置陽性與陰性對(duì)照組，以確認(rèn)是該次實(shí)驗(yàn)的抗體、試劑、組織切片、實(shí)驗(yàn)過程的問題，還是靶蛋白自身表達(dá)量低的問題。
IHC非特異性染色/背景值比較高
問題	解決方案
固定方式或組織自身可能存在自發(fā)熒光	a. 嘗試用非醛類替代醛類。 b. 用淬滅自發(fā)熒光的染料或方法處理組織樣品：如短波長的UV照射、蘇丹黑等。 c. 將石蠟包埋樣品的方法換成冰凍切片（OCT或明膠），減少固定液的影響。 d. 選擇不會(huì)與自發(fā)熒光競爭的熒光染料。福爾馬林、PFA或戊二醛等會(huì)產(chǎn)生高背景的熒光，尤其在使用綠色、藍(lán)色和紅色波長光譜范圍時(shí)；組織中的紅細(xì)胞或膠原蛋白等組分會(huì)產(chǎn)生很強(qiáng)的自發(fā)熒光，尤其是使用綠色和紅色通道的熒光檢測時(shí)。 f. 使用福爾馬林或PFA固定過久。一般建議至少固定6小時(shí)以上，18~24小時(shí)已可滿足大多數(shù)實(shí)驗(yàn)應(yīng)用，注意：如固定時(shí)間到了無法繼續(xù)后續(xù)脫水、包埋程序，一定要將組織置換到PBS保存，切勿一直泡于固定液中，否則有可能造成蛋白交聯(lián)無法修復(fù)。 g. 配置新鮮的固定液
封閉、洗脫或顯色問題	a. 增加封閉液濃度、延長封閉時(shí)間。 b. 更換封閉液成分，注意: 封閉液成分不可與一抗物種同來源，最好與二抗物種同源，如二抗來自馬血清，使用馬血清可得到較干凈的背景。 c. 底物過量：縮短底物孵育時(shí)間。 d. 信號(hào)過度放大：縮短信號(hào)放大試劑孵育時(shí)間。 e. 洗脫液不適合：如果原本是用PBS，可更換使用TBS
抗體濃度太高或非特異性結(jié)合	a. 降低抗體濃度，如1：100調(diào)整為1：1000。 b. 縮短抗體孵育時(shí)間，并在4°c 孵育。 c. 增加封閉緩沖液濃度。 d. 做多個(gè)目標(biāo)蛋白染色時(shí)，建議使用預(yù)吸附二抗減少與其他物種一抗的交互作用。 e. 針對(duì)二抗與組織發(fā)生非特異性結(jié)合的情況建議每次實(shí)驗(yàn)都要設(shè)置一組不加一抗，只加二抗的對(duì)照組，才能確認(rèn)信號(hào)是來自高背景值還是真實(shí)信號(hào)。
內(nèi)源性酶（過氧化氫酶或堿性磷酸酶）	a. 使用酶抑制劑。 - 過氧化物酶：使用H2O2 (0.3% v/v) - 堿性磷酸酶：使用 Levamisol (2 mM)
內(nèi)源性生物素	與 Avidin 孵育以封閉生物素
組織問題	a. 脫蠟不，可能導(dǎo)致細(xì)胞核染色在呈相時(shí)模糊，亦可能導(dǎo)致抗體無法辨認(rèn)抗原或者高背景值。 b. 抗原修復(fù)方式不適合，建議更換修復(fù)溶液成分或方法。 c. 一抗與組織物種同源。較常發(fā)生在使用鼠源抗體染鼠源組織時(shí)，除了避開同樣物種來源的一抗和組織之外，也可以使用 Mouse-on-Mouse IHC染色試劑盒 (GTX83396) 迸行實(shí)驗(yàn)。 d. 任何時(shí)候都不要讓組織干掉。
IHC實(shí)驗(yàn)結(jié)果形態(tài)不佳
問題	解決方案
組織切片從載玻片上脫落	a. 使用新鮮配制、適當(dāng)帶電或疏水處理過的載玻片。 b. 石蠟切片貼于載玻片后，于60°C烘烤3-5小時(shí)最為合適，烘烤不足容易掉片。 c. 實(shí)驗(yàn)過程中要輕柔沖洗載玻片上的組織。
組織切片撕裂、褶皺或有氣泡	a. 切片刀鈍或是刀刃上有缺口。建議使用鋒利刀片重新制備切片。 b. 刀刃上有蠟屑的積留，請(qǐng)隨時(shí)將廢屑?xì)堅(jiān)妹⑶宄蓛簟?/span> c. 刀沒夾緊或刀的角度傾斜。適當(dāng)調(diào)節(jié)切片刀的角度，并確認(rèn)刀片和蠟塊都有夾緊。 d. 移動(dòng)刀座，如果劃痕還是出現(xiàn)在相同位置，應(yīng)該是組織標(biāo)本內(nèi)有污物或硬物的問題。 e. 確認(rèn)組織無過度脫水，并調(diào)節(jié)適當(dāng)切片速度。 f. 在分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果時(shí)，避免損壞切片區(qū)域。 g. 避免展片時(shí)于載玻片上形成的氣泡。
組織形態(tài)分辨率差	a. 制備較薄的切片。一般來說，冰凍切片的片子較厚（約10-30 um），一般設(shè)定刀片溫度為-10~-20度，如設(shè)定溫度太低，可能會(huì)切不好；石蠟切片的片子較?。s5-10 um）。 b. 確認(rèn)已使用適當(dāng)厚度的蓋玻片，如使用油鏡一定要滴油。 c. 建議使用激光共聚焦顯微鏡成像，去除非焦點(diǎn)平面的噪質(zhì)。
固定不或造成物理損傷	a. 增加固定時(shí)間。如使用4 % PFA，一般建議至少固定6小時(shí)以上，18~24小時(shí)已可滿足大多數(shù)實(shí)驗(yàn)應(yīng)用，可依據(jù)染色結(jié)果增加固定時(shí)間與/或加入后固定的步驟。注：如固定時(shí)間到了無法繼續(xù)后續(xù)脫水、包埋程序，一定要將組織置換到PBS保存，切勿一直泡于固定液中。 b. 增加固定液/組織比例，建議固定液體積至少要是組織塊的20倍體積。 c. 準(zhǔn)備較小的組織塊（約3-4 mm），以迸行更q的浸潤固定。
抗原修復(fù)過于強(qiáng)烈	a. 憑經(jīng)驗(yàn)決定保留組織型態(tài)的條件，同時(shí)恢復(fù)抗原的免疫反應(yīng)性。理論上溫度越高，酸堿值越堿，但可能造成較高的背景值或組織型態(tài)破壞，因此，建議從92°C, pH 6開始嘗試，pH 6的抗原修復(fù)液即適用于大多數(shù)抗體。 b. 使用冰凍切片樣本。冰凍切片一般不做抗原修復(fù)，因?yàn)榭乖迯?fù)方式對(duì)冰凍切片可能太過強(qiáng)烈，也不需脫蠟、覆水等步驟，能夠較完好地保存細(xì)胞膜表面和細(xì)胞內(nèi)多種酶活性以及抗原的免疫活性。
切片組織細(xì)胞形成冰晶	a. 防止組織中冰晶形成： -速凍使組織溫度驟降, 減少冰晶的形成。 -固定后將組織置于20％～30％蔗糖溶液1～3天，利用高滲吸收組織中水分, 減少組織含水量，可防止或減少冰晶的形成。

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