Q&A | 液相色譜柱常見問題解答

發(fā)布時間： 2024-07-02　　點擊次數(shù)： 2068次

今天我們就匯總了一些液相色譜柱使用過程中的常見問題，并給出針對性的解決方案。快來看看是不是問到了你的心坎上呢？

問題 1：我的液相色譜柱上進(jìn)樣量多少合適，同時可以避免譜帶展寬？

進(jìn)樣量以及最佳流速受色譜柱尺寸限制。理想情況下，如果樣品與流動相使用相同的溶劑，進(jìn)樣量范圍如下：

液相柱內(nèi)徑 ID	進(jìn)樣量 (µL)
2.1 mm (30 -100 mm 長)	1-3
3.0-3.2 mm (50-150 mm 長)	2-12
4.6 mm (50-250 mm 長)	8-40

問題 2：如果我改用其它尺寸的色譜柱，應(yīng)該如何調(diào)整進(jìn)樣量？

最佳進(jìn)樣量與色譜柱的柱體積相關(guān)，因此取決于色譜柱的橫截面積（A = π r²）和長度（L）。您可以根據(jù)現(xiàn)有方法的進(jìn)樣量估算調(diào)整后的進(jìn)樣量。如果要轉(zhuǎn)換為不同內(nèi)徑（ID）的色譜柱（包裝材料和長度保持不變），只需將當(dāng)前進(jìn)樣量乘以新舊色譜柱的半徑平方之比即可確定新方法的正確進(jìn)樣量。

例如，如果當(dāng)前在 150 x 4.6 mm 色譜柱上進(jìn)樣量為 20 μL，準(zhǔn)備切換到 150 x 3.0 mm 的色譜柱，則新色譜柱進(jìn)樣量為 20 x (1.5²) / (2.3²)，約為 8.5 μL。

問題 3：如果樣品/標(biāo)準(zhǔn)品所使用溶劑比我的初始流動相洗脫能力強(qiáng)，會發(fā)生什么情況？

圖 1：溶劑效應(yīng)對峰形的影響

會發(fā)生溶劑效應(yīng)，通常會導(dǎo)致峰變形、靈敏度差和保留時間縮短等問題。例如毒物分析中的PFAS 分析中的 PFBA 會容易受溶劑效應(yīng)影響，因此我們建議使用與初始流動相相近的溶劑來避免溶劑效應(yīng)。如果不便于這樣做，請在確保溶劑與流動相可以混溶的前提下盡量減小進(jìn)樣體積來消弱溶劑效應(yīng)。

問題 4：如何確定液相色譜柱的總柱體積或空隙體積？

術(shù)語“色譜柱體積"通常是指空隙體積，它代表二氧化硅顆粒之間的流動相體積。空隙體積可以通過總柱體積（ π r² L）乘以對應(yīng)色譜柱的裝填系數(shù)來獲得。對于全多孔色譜柱，計算空隙體積（mL）的公式為 V = 0.68 π r² L，其中 V = 柱體積，單位為 mL；r = 柱截面半徑，單位為厘米；L = 柱長，單位為厘米。對于表面多孔的色譜柱，例如我們的 Raptor 色譜柱，系數(shù)不同，空隙體積（mL）的公式為 V = 0.50π r²L 。

空隙體積通常通過進(jìn)特定標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行實驗測定，該標(biāo)準(zhǔn)品需要在待測色譜柱上無保留或保留可以忽略不計。反相色譜柱常用測試化合物是尿嘧啶。需要注意的是，對于所使用的特定液相儀器，測定值還受到柱外死體積的影響，因此可能會略有不同。

問題 5：使用惰性色譜柱有什么好處？哪類化合物更適合用 Inert 惰性液相柱分析？

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當(dāng)通過 HPLC 分析金屬敏感化合物時，流路中最大的金屬面積是液相色譜柱的柱管。對柱管內(nèi)壁進(jìn)行惰性化處理的 Inert 色譜柱，可以消除金屬敏感化合物與金屬之間的非特異性吸附。從而為這類化合物提供更好的峰形和響應(yīng)。

這類化合物包括：磷酸類化合物、酸性化合物、生物分子-蛋白質(zhì)、核苷酸、寡核苷酸等。

圖 2：待測物與金屬之間的非特異吸附

問題 6：分析金屬敏感化合物時，除了使用 Inert 惰性液相柱，我需要鈍化 HPLC 管路嗎？

如果您使用的液相儀器不是惰性 HPLC 系統(tǒng)，有可能需要對 HPLC 管路進(jìn)行鈍化，因為從進(jìn)樣器到色譜柱之間流路中的金屬可能會對某些金屬敏感化合物產(chǎn)生一定影響。具體鈍化方法，歡迎您聯(lián)系我們獲取針對性的幫助。

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